水産研究センター研究報告第1号

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学 位 論 文 の 要 旨

論文題目 マハタのウイルス性神経壊死症のワクチン開発に関する研究

                            氏 名 山下 浩史

 近年、西日本の海産魚の養殖業においては、主要養殖対象種であるブリやマダイの市場価格が長期にわたって低迷していることに加えて燃油や飼料の価格が高騰し、その経営は非常に困難な状態にある。この現状の打開策の一つとして、販売単価の高い新規養殖魚種の導入が挙げられ、なかでもマハタEpinephelus septemfasciatusは早くからその候補として有力視されてきた。マハタの大量種苗生産技術はほぼ完成したと言えるが、陸上施設での仔稚魚期のみならず海面筏での養成期においても魚類ノダウイルス(ノダウイルス科ベータノダウイルス属)によるウイルス性神経壊死症(viral nervous necrosis: VNN)が頻発し、本種の安定的な養殖生産にとっての最大の障害となっている。なお、魚類ノダウイルスには4種類の遺伝子型が知られており、マハタなどの温水魚のVNNはこのうちRGNNV型による。
 本研究は、養成期のマハタに発生するVNN対策として、不活化ワクチンを独自に開発してその有効性を実証するとともに、本ワクチンの実用化に関わる諸要因について検討をおこなったものである。本論文の内容は以下のように要約される。
 
マハタのVNNと飼育水温(第1章) 
 自然感染したマハタを20〜30˚Cの水温で飼育した結果、20˚Cでの飼育は25℃および30℃に比べてその死亡は緩やかで、かつ累積死亡率も有意に低かった。これは、原因ウイルス(RGNNV)の増殖速度が高温ほど速いこと、またマハタの抗体産生が20˚Cでより優れて促進されることから説明できる。マハタのVNNは水温が概ね25˚Cを超える夏期に発生することから、高水温期の対策として沈下式養殖施設を用いた中低層飼育が有効と考えられた。しかしながら、現状ではこの対策法には制限要因が多い。

マハタVNNに対する予防免疫の可能性(第2章) 
 VNN罹病歴のあるマハタ飼育魚(感染耐過魚)群に対して、RGNNVによる実験感染をおこなったところ、感染耐過魚の死亡率(0~8%)は感染履歴のない対照魚群のそれ(92〜100%)に比べて圧倒的に低かった。自然感染における死亡率においても、対照魚群の累積死亡が51.6%であったのに対して感染耐過魚ではわずかに1.0%であった。このことから、本病に対する予防免疫の可能性が示唆された。

マハタVNNに対する不活化ワクチンの有効性(第3章)  
 VNNに対する予防ワクチンとして、不活化ワクチンを試作し、その安全性および有効性について検討した。ワクチン株として、外被タンパク質遺伝子の情報および病原性を考慮し、愛媛県下でマハタ病魚から分離されたRGNNV SGEhi00株を選定した。ウイルスの培養には魚類ノダウイルスの分離・培養に樹立されたE-11細胞を、ウイルスの不活化にはホルマリンを使用した。不活化ウイルス(ワクチン)を腹腔内に接種されたマハタには異常遊泳や食欲不振等の異常は観察されず、安全性が確認された。不活化ウイルスをマハタに1回接種免疫し、人為感染および野外感染による攻撃試験をおこなった結果、免疫群ではその累積死亡率が対照群と比較し有意に低く(免疫有効率RPS=60%以上)、かつ高い力価(ND50)でのウイルス中和抗体の産生が免疫処理160日後でも確認された。このように、本ワクチンは安全性が高く1回の投与で十分な免疫賦与が長期間にわたって期待されることから、製剤ライセンスを得るプロセスを考慮すると、大腸菌発現ウイルスタンパク質などの既報の抗原と比較して、最も有力なワクチン候補であると考えらる。

マハタVNNの不活化ワクチンの実用化試験(第4章) 
 不活化ワクチンの実用化を目的とし、投与方法等についてさらに詳細な検討をおこなった。まず、注射投与より簡便かつ大量処理また小型魚への適応が可能な浸漬法および経口投与法について検討した。しかしながら、浸漬法、経口法のいずれにおいても、免疫処理魚にウイルス中和抗体の産生は認められず、また実験感染に対する防御効果も確認されなかった。注射免疫法の接種部位としては、筋肉内と腹腔内のどちらにおいても、高い免疫効果が得られた。注射法による最小有効抗原量は、不活化前ウイルス力価で107.0 TCID50/尾であった。また、血中ウイルス中和抗体価(ND50)と実験感染による免疫効果の間には高い相関関係が認められ、魚群の平均でND50=1:200でワクチンの有効性が、またND50=1:300でRPS=60%以上のワクチン効果が期待できる。水産用ワクチンの自家検定や国家検定の際には、通常は不安定要因の多い対象魚種を使った感染防御試験が用いられる。この感染試験に代わってウイルス中和抗体価をワクチン効果判定の指標とすることができることは簡便性に優れ、これは魚類ワクチンのなかで希有な例である。さらに、GCP省令に準拠した野外臨床試験を実施し、不活化ワクチンのマハタに対する安全性と有効性を確認した。

マハタVNNに対するアクアビルナウイルスの効果(第5章) 
 不活化ワクチンのひとつの欠点として、感染防御能が賦与されるまで2〜3週間を要することが挙げられ、この間は魚は無防備である。この欠点を克服するため、不活化ワクチンと同時に非病原性(弱毒性)アクアビルナウイルス(ABV)を接種することによる感染防御効果を調べた。ABVおよび不活化ノダウイルスをそれぞれ単独または同時投与したマハタに対し、RGNNVによる人為感染試験をおこなった結果、ABVと不活化ノダウイルスとの同時接種魚では免疫3日以内に防御能が発現し、その後も高い防御能が持続した。これは、ABVの接種は不活化ウイルスによって誘導される特異免疫(中和抗体産生)を妨げないこと、逆に不活化ウイルスの接種はABVによる非特異的防御(インターフェロン産生)を妨げないことを意味する。従って、ABVと不活化ノダウイルス(ワクチン)を併せて投与することにより、即効性のある非特異防御効果と持続性のある特異免疫が期待され、免疫処理後速やかに海上生簀へ魚を収容することが可能となる。

クエのVNNに対する不活化ワクチンの有効性(第6章) 
マハタと同じく市場価値の高いクエEpinephelus bruneusにもVNNが発生する。人工生産されたクエ種苗を宇和海の4海域で生簀飼育した結果(n=3000)、90%以上の魚がVNNにより死亡した。マハタのVNNに対して有効性が実証された不活化ワクチンの魚種拡大を意図して、クエのVNNに対する効果をみた。その結果、マハタと比較して遜色のない効果(ウイルス中和抗体の誘導および感染防御効果)が不活化ワクチンによってクエに賦与されることが確かめられた。東南アジアなどでの主要養殖対象魚であるハタ科魚類でもVNNが多発しており、また北欧などの冷水魚のVNN原因ウイルス(BFNNV遺伝子型)とRGNNV型は同一の血清型であることから、本研究で開発した不活化ワクチンの適用範囲は広いと考えられる。

ワクチンの実用化にあたっては、国による製造販売承認(製剤ライセンス)を取得しなければならない。このライセンス取得のためには、当該製剤の安全性、有効性および物理化学性状に関する基礎的知見、GLP認証機関における安全性試験、野外臨床試験(GCP)および有効性、安全性に対するロット毎の国家検定ならびに自家検定手法を示す必要がある。総合考察では、本研究で開発した不活化ワクチンの製剤ライセンス取得に関わる必要事項、ならびに将来における養殖現場でのワクチンの使用形態について考察した。
Development of the inactivated virus vaccine against viral nervous necrosis (VNN) of sevenband grouper Epinephelus septemfasciatus

Hirofumi Yamashita

Summary

Marine aquaculture industry has highly developed in Japan. However, because of recent high production cost and low market value of popular marine aquaculture fishes such as yellowtail Seriola quinqeradiata, red sea bream Pagrus major, and Japanese flounder Paralichthys olivaceus, the affairs of the industry are in very poor shape. In order to solve this situation, other fish and shellfish species, particularly with higher market value, have been marked as new target species for aquaculture. Sevenband grouper Epinephelus septemfasciatus, which is one of the most promising species in western Japan, has been targeted but the annual productivity of this species remains still low. The biggest reason is occurrence of a viral disease, viral nervous necrosis (VNN), which frequently causes severe mortality to fish at grow-out stages during net pen culture and there have been no specific way to control it. VNN has been world-wide spreading among a variety of marine cultured fish species for these two decades. The causative virus of VNN, piscine nodavirus (Betanodavirus, Nodaviridae), is a small, round-shaped, unenveloped (25 nm) virus with the genome consisting of two ssRNAs, RNA1 (RNA-dependent RNA polymerase gene, 3.1kb) and RNA2 (coat protein gene, 1.4kb). Currently four genotypes (species), which are identified based on the RNA2 sequences, are known among the Betanodavirus (= betanodaviruses); SJNNV, RGNNV, TPNNV, and BFNNV. The agent of VNN in sevenband grouper was proved to be RGNNV.
The present study aimed to develop a commercially available vaccine, i.e. inactivated RGNNV vaccine, against VNN of sevenband grouper, for the future use in aquaculture industry.

Capture 1. The effect of water temperature on VNN of sevenband grouper
VNN of sevenband grouper usually occurs in summer, when water temperature reaches higher than 25˚C. The temperature dependency of the disease was verified under an experimental condition, where naturally infected fish were reared at different water temperatures and resulted in higher mortality at 25˚C and 30˚C than 20˚C. This was partly explained from a property that RGNNV shows in vitro (cultured cells) the fastest proliferation and highest yield at 25-30˚C, and from the results that immune response of sevenband grouper was higher at 20˚C than 25˚C. These results suggest that mortality can be reduced by rearing fish at lower water temperature, e.g. around 20℃. Therefore, water temperature is an important factor to be considered in vaccination of sevenband grouper.

Capture 2. The possibility of the prophylactic immunization against VNN of sevenband grouper
This chapter aimed to confirm a previous finding that sevenband grouper survived from natural VNN are resistant to re-infection of RGNNV. Sevenband grouper survivors, which had been experienced natural VNN, was challenged by experimental and natural infections. Experimental infection resulted in quite low mortality (0-8%) in the survivors, compared with that (92-100%) in the control fish with no history of VNN. A similar protection of the survivors was also verified in the natural infection challenge; mortalities were 1.0% and 51.6% for the survivors and the control, respectively. This reinforces a possibility of preventing VNN by prophylactic immunization in sevenband grouper.

Capture 3. The efficacy of the inactivated RGNNV vaccine against VNN of sevenband grouper
Formalin-inactivated RGNNV (strain SGEhi00) was selected as a vaccine candidate for sevenband grouper VNN. The virus was propagated in E-11 cells and the infectivity was completely lost after treatment at 0.5% formalin for 10 days (4˚C). The efficacy of the inactivated virus was evaluated by experimental vaccination using juvenile sevenband grouper (average body weight: 12.3g), where fish were injected once intraperitoneally at a dose of 108.1 TCID50/fish with the inactivated RGNNV and reared at 20˚C. Virus-neutralizing antibodies were detected in the vaccinated fish from Day 10 to the end of the experimental period (Day 160), showing the highest mean titers (ND50=1:5,300) at Day 60. Vaccinated and unvaccinated control fish were challenged by intramuscular injection with the homologous virus at 14, 35 and 74 days post-vaccine inoculation. As the result, the vaccinated fish showed significantly lower mortalities at any challenges than the control fish, with 67% or higher RPS (relative percent survival) values. A field trial, in which fish were exposed to natural infection in net pens, also resulted in higher survival rates in the vaccinated fish (RPS=85%) during experimental period of 2 months. This high induction of neutralizing antibodies and protection indicates the potential of the inactivated virus vaccine against VNN.

Capture 4. Some factors to practical use of the inactivated RGNNV vaccine against VNN of sevenband grouper
Some factors required for practical application of the vaccine were examined in this chapter; effective injection site and dose of the vaccine to fish and neutralizing antibody levels to protect fish. Young sevenband grouper, averaging 25.4 g, were immunized by a single intraperitoneal injection of the inactivated RGNNV under water temperature of 25˚C. There were no significant differences in the protection and neutralizing antibody levels in fish vaccinated intraperitonealy and intramuscularly. Fish immunized at vaccine doses of 108.5, 108.0, 107.5, 107.0 and 106.5 TCID50/fish produced the antibodies at mean titers (ND50) of 1:907, 1:511, 1:259, 1:197, and 1:96, respectively, at 20 days post-immunization (p.i.). Neutralizing antibodies were not detected in any fish of the control group (titer < 1:80). When fish were challenged with RGNNV (105.0 and 104.0 TCID50 /fish) at 20 days p.i., cumulative mortalities of the fish groups immunized with 108.5, 108.0, 107.5 and 107.0 TCID50 /fish were significantly lower than those of the control group, and the RPS values were higher than 60% in fish groups immunized with 107.5 TCID50 /fish or higher doses. However, no significant differences were found in mortality between the group immunized with 106.5 TCID50/fish and the control group. From these results, it was deduced that the minimum effective inoculation dose of the vaccine is 107.0 TCID50/fish and the minimum mean neutralizing antibody titer giving significant protection is approximately 1:200. This antibody titer level is possibly used as a measure of vaccine efficacy against VNN in sevenband grouper, instead of a virus challenge test. According to these findings, large-scale field vaccination trials of sevenband grouperwere carried out based on the Ministerial GCP and demonstrated security and efficacy of the inactivated RGNNV vaccine. Capture 5. The protective effect of Aquabirnavirus against VNN of sevenband grouper Immunization of sevenband grouper with the inactivated RGNNV vaccine takes at least 2 weeks to confer enough protection on fish after vaccine injection. Since VNN usually occurs in 10 days of introduction of fish to net cages, fish are defenseless for this period after vaccination. To improve the vaccination system for sevenband grouper VNN, protective efficacy of simultaneous inoculation of the inactivated RGNNV and a non-lethal live aquabirnavirus (ABV) against experimental VNN were investigated, where it is expected that fish will be protected by induced interferon-like substance(s) shortly after injection of ABV. Sevenband grouper (average body weight: 75g) were intramuscularly inoculated with live ABV (stain FBV), intraperitoneally inoculated with the inactivated RGNNV, or both live ABV and inactivated RGNNV, and reared at 20℃. At 3, 7, 14, 21 and 28 day post-inoculation (p.i.), fish were challenged by intramuscularly injection with live RGNNV at 25℃. Untreated control fish showed high mortalities in any challenges. Fish receiving only ABV exhibited significantly lower mortalities in any challenges than the control fish. Similar results were obtained in fish receiving both ABV and inactivated RGNNV, while fish receiving only the inactivated RGNNV showed high protection against betanodavirus challenge only at 21 and 28 day p.i. There were no differences in RGNNV-neutralizing antibody titers among fish inoculated RGNNV vaccine with or without ABV. This indicates that the live ABV dose not interfere with specific immune response conferred by inactivated RGNNV and vice versa the inactivated virus dose not interfere with non-specific protection by ABV. Therefore, incorporation of ABV to the RGNNV vaccine will be useful especially for rapid onset of non-specific protection against VNN. Capture 6. Application of the inactivated vaccine to VNN of kelp grouper Kelp grouper Epinephelus bruneus, which is another candidate for marine aquaculture, is also very susceptible to piscine nodavirus (RGNNV) at the grow-out stages. In this chapter, the inactivated RGNNV vaccine was evaluated for its efficacy against VNN of kelp grouper. Fish received a single intraperitoneal injection with the vaccine produced virus-neutralizing antibodies with the highest titer 1:1,522 at 14 day post-injection. Vaccinated fish showed high protection against injection challenges by the homologous virus, with RPS values of 73.3- 88.9%. A field trial, in which fish were exposed to natural infection in net pens, also resulted in higher survival rates in the vaccinated fish (RPS=57.2%) during experimental period of 6 weeks. This protective effects of the inactivated RGNNV vaccine against kelp grouper VNN suggests a potential of the vaccine to not only RGNNV infections in other grouper species but also BFNNV infections in cold water species because of serological similarity between RGNNV and BFNNV. In the last chapter, immunization system of sevenband grouper with the present inactivated RGNNV vaccine was verified and discussed from various angles, including requirments to get drug license from the government. 第6章 総 括 本研究では,底泥に堆積した珪藻類のフラックス記録より,植物プランクトン群集の長期変動の特徴とその支配要因(北太平洋全域におよぶ数十年スケールの気候変動,それに伴う黒潮変動,底入り潮の変動との関連性)について検討した.この長期変動の研究を契機として,透明度の逆数(1/Tr)を植物プランクトン現存量の指標として用いて,植物プランクトン群集の中期変動とその要因について解析を行った.また,植物プランクトン組成の経年変化と環境要因との関係から植物プランクトン群集の変動要因について詳細な解析を行った.さらに,豊後水道東部沿岸域ではこれまで実測例のない基礎生産速度の周年観測をおこない,季節変動の把握と環境要因との関連性について検討した.しかし,その一方で,今後解明すべき課題も明らかとなった.そこで本章では,これまでに述べた研究成果を整理し,総括と今後の課題について述べる. 長期変動解析では,豊後水道東部沿岸域の下波湾における過去100年間(1900 - 2000年)の底泥への珪藻フラックス(堆積速度)から,植物プランクトン現存量(もしくは生産量)には,1943年頃と1982年頃を分岐点とした20 - 40年周期の変動が認められ,この変動はPDO indexの変動と同調していることが明らかとなった.このことから,豊後水道東部沿岸域における植物プランクトン現存量の長期変動には,以下のようなシナリオが考えられる(Fig.6-1).PDO indexが高い時,亜熱帯循環が強いため,黒潮流量は十年規模で増加する.流量増加に伴い黒潮は大蛇行期へと移行し,四国沖で黒潮が接岸傾向になると,陸棚斜面上で冷水の湧昇が起こる.豊後水道南部の冷水の湧昇は,底入り潮によって豊富な栄養塩が豊後水道に供給されることから,結果として基礎生産が高まる.しかしながら,PDO indexが低い時,亜熱帯循環は弱くなり,黒潮の流量が低下するため,黒潮は四国沿岸に接岸せず,沖合を直進し,陸棚斜面上の冷水の湧昇が起こらない.底入り潮による栄養塩供給が行われないため,基礎生産が低下する.このようなプロセスにより,底入り潮が植物プランクトンの変動に影響を及ぼしている可能性が高いことが長期変動解析の結果,示唆された. 中期変動解析の結果,植物プランクトン現存量の変動パターンには10年程度(もしくはそれ以上)の周期性が存在することが示された.底層水温が低く,急潮強度が強い年代(1980年代)は,黒潮が接岸傾向にあり,底入り潮が強かったため,植物プランクトン現存量が高かったと考えられる.これに対して底層水温が高く,急潮強度が弱い年代(1990年代)では,黒潮が離岸傾向の場合が多く,底入り潮による湧昇が起きないため,栄養塩の供給が不十分となり,植物プランクトン現存量が低下したものと推察される.一方,2000年代は,底層水温は高かったものの,急潮強度が強いことから,底入り潮が発生し,表層への栄養塩供給は行われたことから,植物プランクトン現存量が上昇したものと考えられた(Fig.6-2). 前述の植物プランクトンの現存量とほぼ同期するような形で属組成にも特徴的な変動が認められている.ひとつは,1987/88年頃を境に全珪藻類に占めるSkeletonema spp.の割合が急激に低下したことであり,豊後水道東部沿岸域における1980年代後半から1990年代の植物プランクトン現存量の減少は,Skeletonema spp.の個体群の縮小が大きく関与しているものと考えられる(Fig.6-2).統計解析の結果,Skeletonema spp.の個体群の変動はDIPの変動と密接な関係にあることがわかったが,Skeletonema spp.の増殖には比較的高濃度の栄養塩(特にリン酸塩)が必要であるとの知見もあることから,栄養塩の供給量(特に夏季を中心とした季節)が減少した結果,増殖に高濃度の栄養塩を必要とするSkeletonema spp.が衰退したものと推測された.実際,この年代の底層水温は高く,急潮強度は弱く,黒潮の流軸は離岸傾向にあることから,底入り潮の発生が弱く,栄養塩供給が妨げられた可能性が考えられる(Fig.6-2).組成変化が観察された年代の栄養濃度の実測値は,1980年代はじめの頃の半量程度と少なかったことも,底入り潮による栄養塩供給が低下していることを裏付けるものである. 植物プランクトン属組成の変化に見られるもうひとつの特徴的な変化は,1990年代後半以降に全珪藻類に占めるPseudo-nitzschia spp.の割合が増加したことである.統計解析の結果,これらの変動は水温と密接な関係にあることがわかった.1978年から2007年までの30年間に水温は約1.5℃上昇しており,これらの現象は温暖化による影響と推察され,結果として高水温期に多く出現するPseudo-nitzschia spp.の増殖を促進させた可能性が考えられる.その一方,Pseudo-nitzschia spp.の割合が増加した時期は,底層水温は高い傾向にあるものの,急潮強度は上昇し,底入り潮が再び強くなり始めた時期とも重なる(Fig.6-2).底層水温の高水温化や栄養塩濃度の実測値が1980年代レベルまで回復していないことを考慮すると,2000年代は底入り潮により供給される栄養塩が1980年代よりも低下していた可能性が高い.Pseudo-nitzschia spp.の生理・生態学的特性知見は乏しく,詳細な検証は困難だが,本属の多くは他の珪藻類と比較すると細胞サイズが小さいことから,低濃度の栄養塩環境においても,個体群を維持することが可能であると推察される.したがって,本論で示した植物プランクトン群集の変動は,栄養塩濃度(底入り潮)に鋭敏に応答したものと考えられる. 短期変動解析では,下波湾で2000年代前半に周年にわたって比較的高頻度で植物プランクトンの基礎生産速度の実測を行い,その季節変動の特徴や環境要因との関係について検討した.その結果,豊後水道東部沿岸域では,基礎生産速度は4 - 10月に高く,11 - 3月は低い傾向にあり,夏季にも高い基礎生産速度が維持される場合があることがわかった.Chl a現存量の季節変動も基礎生産速度とほぼ同様の傾向を示し,両者には有意な相関関係が認められたが,夏季については変動が大きい特徴が認められた.基礎生産速度は,周年を通して水温や光量子量により律速されていたが,短期変動の大きい夏季は栄養塩濃度(NOx)も大きく関与していることが明らかとなった.したがって,当海域の栄養塩環境に大きな影響を与える底入り潮は,植物プランクトンの基礎生産速度にも影響を及ぼしている可能性が示唆された. 以上のように,豊後水道における植物プランクトンの変動には,長期的な観点から,北太平洋全域に影響する気候変動とそれに伴う黒潮変動が大きく関与していることがわかった.中でも黒潮の流軸位置,流量と密接な関係にある底入り潮は,これら変動との関連性が強く示唆された.植物プランクトンの現存量,属組成の中期的な変動の変遷から,夏季(晩春-初秋)の豊後水道は,- 1987/88年(現存量が高く,優占種はSkeletonema spp.とChaetoceros spp.),1989 - 1997/98年(現存量が低下,Skeletonema spp.が衰退し,Chaetoceros spp.が優占),1999年-(現存量が再び増加,Skeletonema spp.が再び個体群を拡大するとともに,Pseudo-nitzschia spp.が台頭)の3期に分けられ,各期間の変遷は底入り潮の強度の推移とも概ね一致していることがわかった(Fig.6-1).また,周年にわたり実施した植物プランクトンの生産量に関する調査結果(上記長期変動解析における第3期に相当する期間に実施)からも,夏季の生産量が底入り潮に代表される外海域からの栄養塩の供給に依存しており,短期変動の点からも示唆された.以上の一連の研究成果から,底入り潮の規模や頻度は,長期から短期に至る時間スケールの違いに関係なく,豊後水道東部沿岸域における植物プランクトンの現存量のみならず,生産量や組成にも多大な影響を及ぼしていることが明らかとなった. 一方で,1990年代後半からのPseudo-nitzschia spp.の台頭など,底入り潮の変動だけでは説明が困難な現象も認められた.Pseudo-nitzschia spp.の組成比の上昇を1990年代中頃の底入り潮強度の低下に伴う栄養塩供給量の減少と関連づけると,説明可能となるものの,第4章の結果では,2000年代以降,底入り潮の強度が回復されつつあるにもかかわらず,Pseudo-nitzschia spp.の組成比は高い値を維持しているように見受けられる.この点については,底入り潮による栄養塩の供給メカニズムのみで充分に説明することが困難であり,別の観点から考察する必要があることを示唆している. 豊後水道東部沿岸域における植物プランクトンの中心は珪藻類と鞭毛藻類であるが(第4章),両者は互いに拮抗した関係にあり,急潮,底入り潮による珪藻類の増殖機構が機能しなければ,珪藻類の増殖が制限され,相反する現象として鞭毛藻類の赤潮が形成されることが明らかにされている(Fig.1-4参照).このような植物プランクトンの増殖メカニズムを考える上で鍵となるのは,①底入り潮による栄養塩の供給と②急潮による光環境の回復である.前者は栄養細胞が増殖するために必要な栄養塩の供給源としての機能,後者は底泥中に存在する休眠期細胞の休眠を解除し発芽を促進する機能という点に集約される. 最後に,今後の展望にもつながる②急潮による光環境の回復について述べる.植物プランクトンのブルームの大きさは,水温や塩分,栄養塩濃度,光条件などの環境要因に加え,シードポピュレーションの規模にも影響される.本研究では主に栄養塩の供給メカニズムを中心とした環境要因の変動という観点から議論を進めてきたが,底泥中の休眠期細胞をシードポピュレーションとする場合と水柱に残存する栄養細胞群をシードポピュレーションとする場合とではブルームの大きさに2 - 3倍の差があるとも言われており(MaQuoid and Godhe,2004),シードポピュレーションの起源や寄与率を知ることは,当海域の基礎生産を明らかにする上で重要なことと認識される.豊後水道東部沿岸域の下波湾における水深3 m層のChl a濃度の経年変化を見ると,2001年以降,夏季のChl a濃度が低め基調で推移している.この要因のひとつには本論でも指摘してきたように底入り潮の発生頻度の低下に伴う栄養塩の減少が当然考えられる.しかしながら,近年では当海域の栄養塩供給源である底入り潮の規模は,1990年代初期よりも回復傾向にあり(2章),栄養塩の動態だけで説明するのは困難であり,急潮による光環境の回復に伴う休眠期細胞の発芽についても併せて考慮する必要があるだろう.今後は,底泥からの休眠期細胞の発芽量や水柱に残存する栄養細胞,湾外から供給される栄養細胞のシードポピュレーションとしての貢献度合いを定量化し,当海域における珪藻類の増殖機構を明らかにする必要がある.